流動相管理

純度與過濾：使用色譜純級或更高純度的試劑配制流動相，避免使用分析純?nèi)軇蚱浜械奈⒘侩s質(zhì)（如有機溶劑中的聚乙二醇、無機鐵離子等）會影響色譜柱性能。流動相需經(jīng)0.45μm或更小孔徑的濾膜過濾和超聲脫氣處理，減少灰塵、微生物等雜質(zhì)堵塞色譜柱，尤其是水溶性流動相易引起微生物生長而造成色譜柱阻塞。流動相最好是現(xiàn)配現(xiàn)用，放置時間最好不要超過2天。

pH控制：pH的流動相會破壞填料內(nèi)的共價鍵，“溶解”硅膠，使固定相流失，從而降低柱效，縮短使用壽命。以硅膠作基質(zhì)的固定相一般要求pH在2.5-7范圍內(nèi)使用，長期在pH>7或pH<2使用環(huán)境中，硅膠會逐漸溶解或者表面鍵合的官能團會逐漸流失。如果一定要用高或低pH的流動相，最好是選用相適應的色譜填料。

緩沖鹽處理：若分析時流動相中含有緩沖液（通常為鹽溶液），沖洗時宜用水取代緩沖液與有機相混合沖洗色譜柱（20倍柱體積），再用100%有機溶劑沖洗。若直接用100%有機溶劑沖洗，可造成緩沖液沉積析出，從而損壞柱子品質(zhì)。同樣的，若流動相中加入酸、堿溶液時，也應當先采用高比例的水（水：甲醇，10：90）沖洗20倍柱體積，防止強酸強堿溶液導致硅膠基質(zhì)填料的溶解。

色譜柱維護

清洗與再生：柱子使用一段時間后，總會有一些雜質(zhì)累積在柱內(nèi)，影響色譜柱的分離性能，通常表現(xiàn)為柱壓升高、基線不平、色譜雙峰、分離性能降低等。這些被污染的色譜柱經(jīng)清洗后，可恢復部分甚至大部分分離能力。以硅膠基質(zhì)色譜柱為例，使用后需經(jīng)較強的流動相沖洗。通常情況下，在使用硅膠、氧化鋁、極性鍵合相色譜柱時，每次用完后可先用二氯甲烷或正己烷等溶劑低流速長時間的沖洗；鍵合反相硅膠色譜柱、離子交換色譜柱和凝膠色譜柱可先用高比例的水（甲醇水混合溶劑）沖洗，再用100%甲醇沖洗。此外，色譜柱低流速的反相沖洗能夠有效除去堵塞在柱頭或篩板上的雜質(zhì)，以及清洗聚集在柱頭部位的較強吸附物質(zhì)。有些色譜柱在許多方法處理污染失效后，反過來使用，不僅柱壓降變小，柱效也可恢復如初，延長了色譜柱的使用時間。若上述常規(guī)清洗法無法清除污染物，則有必要采用更強的洗脫劑清洗，如反相材料的沖洗順序為：100%甲醇→100%乙腈→乙腈：異丙醇（75：25，V/V）→100%異丙醇?；蛘呖梢圆捎幂^低濃度的稀酸或稀堿可將有機溶劑不能洗脫的污染物除去。例如采用0.05mol/L的硫酸和流動相溶液沖洗色譜柱，可取得良好效果；或者采用1%氫氧化銨或50%二甲基甲酰胺水溶液，對聚集在柱頭的污染物具有良好的清洗效果。蛋白質(zhì)對反相色譜柱的污染已成為常見問題，尤其在分離未經(jīng)處理的動物組織等生物樣品。一般情況下，純有機溶劑如乙腈或甲醇不能很有效地清洗色譜柱，因而需要一些特殊的清洗方法。

保護柱使用：“保護柱”是與所使用液相色譜柱相同填料的短型色譜柱，可以有效地阻攔容易損壞色譜柱的大分子和不溶性顆粒，過濾易沉著色譜柱上產(chǎn)生死吸附的物質(zhì)，從而延長色譜柱使用壽命。

操作規(guī)范

流速與柱壓控制：粒徑為1.8μm的UPLC的流速常設為0.3-0.5mL/min，粒徑為5μm的HPLC分析流速不大于1.5mL/min，粒徑為10μm半制備柱流速控制在3mL/min。流速過大，壓力升高，會引起色譜填料沖垮、塌陷。每次開機使用分析儀器時，泵啟動太快，流速和柱壓的瞬間升高，柱床受到?jīng)_擊，引起紊亂，產(chǎn)生空隙，影響色譜柱的使用壽命。因此，在操作實驗開始時，應當將流速和柱壓逐漸增加。

溫度控制：不同類型的色譜柱耐受的溫度各有差別。通常色譜柱溫維持在10-40℃之間，能夠充分、較優(yōu)地發(fā)揮色譜柱的性能。